楊樹 (Populus) 是重要的造林樹種，也是研究林木基礎(chǔ)生物學(xué)性狀的模式材料。此外楊樹可與多種真菌 (外生菌根真菌、叢枝菌根真菌和內(nèi)生真菌)類群建立共生關(guān)系。目前，在楊樹-真菌互作體系中，通過構(gòu)建楊樹-雙色蠟?zāi)?(Laccaria bicolor) 和卷緣樁菇 (Paxillus involutus) 互惠共生提高楊樹非生物脅迫能力的生理機(jī)制方面的研究已取得多項(xiàng)突破，而關(guān)于楊樹-根系內(nèi)生真菌互作的研究較少。我們構(gòu)建了楊樹-根系真菌悉生共生體系，為揭示樹木和根系真菌之間互惠共生機(jī)制提供理想模型。該體系能夠基于不同目的使用不同培養(yǎng)容器來研究真菌對樹木的影響，這在現(xiàn)有的樹木-外生菌根共生體系中很少見。構(gòu)建楊樹-真菌互作體系是研究一系列如共生真菌侵染結(jié)構(gòu)觀察、互作轉(zhuǎn)錄組研究等生物學(xué)問題的關(guān)鍵，并且有助于加深理解共生真菌對林木表型和生理代謝的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。
 

實(shí)驗(yàn)步驟

一、真菌材料的準(zhǔn)備

1.菌餅接種劑準(zhǔn)備

       1.PDA培養(yǎng)基滅菌后取出，室溫下放置，待培養(yǎng)基溫度約45 °C后，倒入15 ml PDA培養(yǎng)基至一次性塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后（約1 h后），進(jìn)行接種處理。

       2使用接種針從純培養(yǎng)真菌菌落邊緣挑取菌塊，接種至PDA固體培養(yǎng)基表面，置于培養(yǎng)箱26 °C黑暗條件下培養(yǎng)。

       3.待培養(yǎng)7 d后，自菌落邊緣使用打孔器 (直徑7 mm) 取菌餅作接種劑。

二、楊樹幼苗無性系組培擴(kuò)繁

1.楊樹無性系組培苗生根培養(yǎng)和繼代繁殖

       采用組培快繁的方法在短期內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)楊樹無菌幼苗。以美洲黑楊雜交優(yōu)良無性系NL895楊 (Populus deltoides×P. euramericana cv. ‘Nanlin895’，NL895) 和毛白楊 (P. tomentosa) 為例。

       1.超凈工作臺紫外消毒后，將楊樹組培苗幼莖 (帶葉片)剪斷，高度約為2 cm，轉(zhuǎn)接至改良MS (秦媛，2017) 生根培養(yǎng)基 (配方見表1)中，使組培苗直立，并盡量避免葉片碰到培養(yǎng)基，每個組培瓶扦插3-4株幼莖，蓋上組培瓶蓋。轉(zhuǎn)移到組培室中，保持溫度25 °C，濕度60 %，設(shè)置光周期12 h (光照強(qiáng)度為20, 000 Lx)。

       2.幼苗生根培養(yǎng)3周左右，苗高達(dá)到5-6 cm后，將組培苗取出進(jìn)行繼代繁殖。操作步驟同上。然后選取根系大小、發(fā)達(dá)程度和株高 (5-6 cm)較一致的無菌幼苗，進(jìn)行共培養(yǎng)接種實(shí)驗(yàn)。

三、楊樹無菌幼苗-根系真菌互作體系構(gòu)建

1.大培養(yǎng)皿共培養(yǎng)體系

       1.超凈工作臺紫外消毒后，無菌大培養(yǎng)皿 (直徑150 mm)中倒入100 ml楊樹-真菌共培養(yǎng)培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基在大培養(yǎng)皿中凝固后呈斜面 (如圖1所示)。

       2.將挑選的根系和株高較為均一的楊樹無菌幼苗用鑷子輕輕取出，用無菌水小心洗除幼苗根部的瓊脂，轉(zhuǎn)接至大培養(yǎng)皿共培養(yǎng)基表面，每皿3株幼苗。使無菌苗根系貼附于共培養(yǎng)培養(yǎng)基表面，地上部分放置于不含共培養(yǎng)基的一側(cè) (如圖1所示)，用封口膜進(jìn)行密封，防止污染。然后轉(zhuǎn)移至70L光照培養(yǎng)箱中，25 °C，設(shè)置光周期12 h (光照強(qiáng)度為20, 000 Lx)，培養(yǎng)7 d。

       3.待培養(yǎng)7 d后，將步驟一中獲得的菌餅接種劑，隨機(jī)挑取5個均勻轉(zhuǎn)接至根系周圍 (菌餅距皿壁約1.5 cm，如圖1所示)，對照組接種無菌PDA瓊脂塊，用封口膜進(jìn)行密封，防止污染。再次轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中，25 °C，設(shè)置光周期12 h (光照強(qiáng)度為20, 000Lx)，繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)共培養(yǎng)時(shí)間，然后取樣進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。

2.大試管共培養(yǎng)體系

超凈工作臺紫外消毒后，無菌玻璃大試管 (直徑25 mm，長度240 mm，瓶口帶透氣硅膠塞)中倒入60 ml楊樹-真菌共培養(yǎng)培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后待用。將步驟二挑選的根系和株高較為均一的楊樹無菌幼苗用鑷子輕輕取出，放入裝有無菌水的玻璃大培養(yǎng)皿中，小心洗除根部的瓊脂，并用無菌濾紙吸干表面水份后，轉(zhuǎn)接至大試管共培養(yǎng)培養(yǎng)基表面，并使無菌苗根系貼附于共培養(yǎng)培養(yǎng)基表面 (如圖2所示)。大試管瓶口用透氣硅膠塞封口，并在透氣硅膠塞上蓋一層錫箔紙，再用塑料保鮮膜進(jìn)行密封，防止污染。而后，轉(zhuǎn)移至70L光照培養(yǎng)箱中，25 °C，設(shè)置光周期12 h (光照強(qiáng)度為20,000 Lx)，培養(yǎng)7 d。待培養(yǎng)7 d后，接種真菌菌株，每株無菌幼苗僅接種1個菌餅。

注：大培養(yǎng)皿體系主要目的是用于直觀的觀測根系內(nèi)生菌對樹木根系的促生作用，而大試管體系的目的是使根系內(nèi)生菌*侵染根系后可用于盆栽試驗(yàn) (耐鹽、耐旱等)。

從大培養(yǎng)皿楊樹 (NL895楊)-真菌共培養(yǎng)體系和培養(yǎng)21天后的NL895楊生長狀態(tài)能看出該菌株能夠顯著促進(jìn)NL895楊根系的生長發(fā)育，培養(yǎng)7天后的毛白楊生長狀態(tài)，可以看出該菌株可以顯著提高毛白楊的鉀離子吸收，這些就是楊樹根系真菌互作體系構(gòu)建方法，如果還有什么疑問，歡迎聯(lián)系上海喆圖科學(xué)儀器有限公司。